酶标仪即酶联免疫检测仪，是酶联免疫吸附测定的特殊仪器。今天，本文将向您介绍酶标仪的试验方法，快来和小编一起了解一下吧！
仪器酶标仪
酶标仪的试验方法
酶标仪实际上是一种伪装的专用光电比色计或分光光度计，其基本工作试验方法基本相同作为主要结构和光电比色计。该图是单通道自动注射酶标仪的工作试验方法。由光源灯发出的光波通过滤光器或单色器变成单色光。待测试样进入塑料的微孔杆。部分单色光被样品吸收，另一部分通过样品照射到光电探测器上。光电探测器将样品与样品分离，强度和强度不同。信号被转换成相应的电信号。电信号由前置放大器，对数放大，模数转换等处理，然后发送到微处理器进行数据处理和计算。**后，显示器和打印机显示，微处理器也受控制。该电路控制机械驱动机构在X和Y方向上的运动，以移动微孔板以实现自动注射检测过程。其他微孔板读取器使用手动移动微孔板进行检查，因此无需X，Y定向机械驱动结构和控制电路使仪器更小，结构更简单。
微孔板是一种专门用于放置待测样品的透明塑料板，一个大小均匀的小孔，相应的抗原或抗体嵌入孔中，微孔板上的每个小孔都可以容纳几毫升的溶液。
光是电磁波，100nm到400nm的波长称为紫外光，人眼可以观察到400nm到780nm之间的光，并且光线超过780nm称为红外光。人们只能看到颜色，因为光线在物体上反射并被物体反射回来。绿色植物绿色的原因是大多数植物吸收红橙色和蓝紫色光，但它们不吸收和反射绿色，因此植物看起来是绿色的。酶标仪的试验方法是检测特定波长下分析物的吸光度。
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近年来，市面上的多功能酶标仪不仅有传统优势品牌形成三足鼎立之势，还出现了很多后来者加入战局。这些品牌在产品特性、技术参数、功能指标方面都截然不同，小编就为各位探讨一下，选择多功能酶标仪需要注意到的一些因素，希望能帮助各位找到适合的产品。 一、滤片Vs光栅 多功能酶标仪的分类方法众多，但简单的莫过于用他们的滤光方式来作分界线。一般来说，可以分为滤光片型和光栅型两大类。当然也有一些机器里面同时装上了滤光片和光栅。但是滤片和光栅并不能同时完成同一个检测，还是想用光栅的时候用光栅，该用滤片的时候用滤片；还有一些实验非用其中一个不可，另一模块实现不了的。所以这类仪器本质上还只是把滤片和光栅放在了一起，并没有使两者糅合而产生新的技术突破。 总体来说，滤片技术由于发展已久，配合二向色镜(其实也就是另一模式的滤光反光滤镜)等光路系统，可以实现大部分实验的需要。但是滤光片型仪器由于受限于滤片的波长和数量限制，不可能满足日益增加的实验类型的检测需要，而且有时需要对物质的吸收、激发和发射光谱进行研究，所以后来就诞生了光栅型的仪器。光栅型酶标仪的推陈出新，使得用户在波长选择上不再受限，而且在杂光率、带宽控制等性能上还超越了滤光片系统。这些都是目前滤光片型酶标仪所不能或者较难实现的。 二、杂光率&波长准确性 光栅型滤光系统俨然已经成为了目前通用性多功能酶标仪的主流，多家厂家共同努力，已经把光栅技术推到了历史新高。在光栅的众多技术参数之中，关键的无疑就是光栅的杂光率和波长选择的准确性了。 杂光率指得就是光源通过光栅后，得到的光线中，“不需要”的波长的光占所标称波长的光的比例，表征了滤光的纯度。由于光线干涉、衍射等的复杂性，无论使用滤光片还是光栅，杂光都是不可避免的。各种滤光技术的本质就是要想办法把杂光尽可能地去掉。 一般来说，滤光片型的杂光率在10-4～10-5之间，光栅型的可以做到10-6～10-7。由于此类杂光是非特异的，而且会直接进入检测器，所以有多少的杂光就会引入多少的随机误差。在荧光等检测过程中，由于检测器存在放大效应，杂光率的干扰也会被指数级放大。因此，杂光率就是一个滤光系统的首要性能指标。 光栅的另一个重要指标就是波长选择的准确性。因为很多检测是依赖于物质在某个波长的特征图谱。就像DNA/RNA的OD260浓度测定，实际检测波长偏离260nm几个nm以上的话，OD值与浓度之间的数学关系就会发生改变。因此，一组性能优良的光栅系统，他的波长选择准确性应该是在±0.5～1nm之间。波长偏离过大有时就会影响到结果的准确性。 这两个可谓是光栅甚至滤光片滤光系统关键的技术参数，直接影响到的是得到数据是否是真正所要测量的结果，是实验结果可靠性的基本要求。 三、认证>参数 在保证检测可靠的基础上，不同仪器的下一个差异就体现在检测的灵敏度上面，这时人们关心的就是仪器能够检测到多弱的信号。 灵敏度涉及了整个光路系统的设计和选料，很难说某一个部件会起决定性作用。但是有一点，在各种单功能检测项目中，光吸收检测用非放大型的光电二极管、荧光检测用光电倍增管、发光检测用专门设计的单光子计数光电倍增管，这三种不同的检测器是各自检测领域的优先选择。 各单项检测的结果都是用相应检测器完成的。当然也有的仪器出于成本等考虑，用一个检测器兼容多种检测模式，这在一定程度上也能完成实验需求，但是在性能上也会有所牺牲折中，无法实现各项检测都达到优化。 关于灵敏度的定义和检测标准，每个厂家都有各自的描述，都会说自己是怎样怎样好，很难有一个直观的客观比较。因此，某些试剂厂家就站了出来，对某些仪器的检测性能提供一个第三方的认证。 比较常见的是发光检测领域里面的Promega公司DLReady认证，荧光检测领域的Invitrogen公司的LanthaScreen系列认证、Cisbio公司的HTRF认证、BellBrook实验室的Transcreener认证等等。这些认证主要是针对公司提供的某一类型的要求较高的试剂盒，涵盖了对检测仪器的各种性能要求，包括：检测方法是否能用，灵敏度、线性范围、孔间干扰等是否满足要求等等。 如果需要做相关的实验，例如做Luciferase发光检测的就看看仪器是否有DLReady认证、做TR-FRET的就看看HTRF认证、做FP就看看Transcreener认证，如果机器拥有相关的认证，就可以说明该机器在一定程度上能够较好地满足类似检测的各种需求，远比单单比较一个灵敏度参数更能说明问题。因为一个实验能否做好并不是单单一个灵敏度就能表征的。 需要特别注意的是，LanthaScreen是一个系列的认证，涵盖了FI、FRET、TRF、FP等多个子项目，不同仪器所通过的子项目是不一样的，需要上Invitrogen网站仔细查询核对。 光栅型的仪器由于新技术近几年才逐渐兴起，受限于技术研发和仪器成本，同一个价格范围内的灵敏度等指标会略差于发展成熟的滤光片机器。所以，在中档多功能酶标仪领域，拿到了各种认证的光栅型仪器并不多见。 而作为新一代光栅型酶标仪的代表作，TECAN M1000已经拿到了全部上述四种认证，而且在灵敏度等单项性能上也已经超越了不少的中滤片型酶标仪。 这说明了光栅型酶标仪的研发又进入了一个新的高度，除了在灵活性上取得了无可替代的作用外，还在检测灵敏度等方面也逐渐替代传统的滤光片型酶标仪。光栅型是科研领域多功能酶标仪的未来主要发展趋势;而滤光片型仪器也正在往单项性能更优的方面改进。 四、比色杯+微量检测 除了常规的6～384/1536孔酶标板检测之外，有些仪器还附带了比色杯、微量检测板等的兼容功能。无论是使用立式比色杯、卧式比色杯还是各种微量检测板，其目的都是给光程不固定的酶标板检测引入一个标准光程的概念。虽然酶标板检测也能通过光程校正等方式实现10mm光程OD值的换算，但这只是一个数学转换过程，检测误差累积较多，实际使用效果不佳。引入比色杯和微量检测板后，光吸收的检测光程就被固定在10mm或者0.5mm等的标准长度，OD值换算更加简单和准确。附带了此类检测功能的酶标仪，相当于除了本身的多功能酶标检测之外，还能替代部分分光光度计的功能，使其功能更加全面，仪器的性价比更高。 目前，部分品牌已经在国内多个城市设立了分公司、办事处或者工程师。选购之前可以多与工程师交流，充分了解各家的性能特长和售后情况，反复对比，总能找到适合自己需要的一款多功能酶标仪。
酶标仪的使用方法
酶标仪其基本功能不外乎一个比色测定，所不同的是在测定波长范围、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量测定软件功能等方面的差异，当然全自动酶免疫分析系统还具有自动洗板、温育、加样等功能。在临床实验室实际工作中，实验人员在使用酶标仪进行测定操作时，有时难免会对酶标仪的一些性能指标产生迷惑，甚至对酶标仪的应用产生错误的理解。
一、测定波长
目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶(HRP)，底物通常为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)，其在过氧化氢溶液的存在下，经HRP作用，分别氧化为2,2,-二氨基偶氮苯(DAB)和联苯醌。当pH值为5.0左右时，DAB在450nm波长处有**大吸收，当pH值降为L0时，**大吸收波长移至492nm,同时摩尔消光系数变大，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有**大消光系数，如果HRP量少，H:O:和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH,即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min。因此，450nm和492nm两个波长是目前ELISA测定**常用的。酶标仪有单波长和双波长检测功能有时使用者不知在什么情况下使用单或双波长检测。所谓的“单波长”就是使用一种对显色具**大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定；而“双波长”则除了用对显色具**大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630nm进行测定，酶标仪**后打印出来的吸光度则为二者之差。630nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板子上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，**好使用双波长，且不必设空白孔。
二、测定的吸光度范围
酶标仪的吸光度测定范围在。0-2.5之间即可以满足ELISA的测定要求。早期的酶标仪可测定的吸光度一般在0-2.5之间，但现在基本上都做了拓宽，可达到3.5以上，并且能保持很好的精密度与线性。
三、光学系统
酶标仪的光学系统采用的是垂直光路多通道(通常为8或12通道，亦有单通道)检测，一般为硅光管或光导纤维，除测定通道外，有的酶标仪还有一个参比通道，每次测定可进行自我校准。酶标仪的光学系统功能如何，均可通过酶标仪测定的吸光度范围、线性度、精密度和准确度等体现出来。光学系统好的话，则上述指标也应较佳。测定的精密度与测定通道之间的均一性有直接关系。单通道可避免因通道不同所致的差异。
四、检测速度
酶标仪的检测速度是指其完成比色测定所需要的时间。检测速度快，有利于提高检测的精密度，即避免由于测定过程中，因测定时间不同所致的各微孔间吸光度间的差异。
五、震板功能
酶标仪的震板功能是指酶标仪在对ELISA板孔进行比色测定前对其进行振荡混匀，使板孔内颜色均一。目前市场上常见的酶标仪均有震板功能，所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋转等方式及振荡幅度等任意调节。使用有震板功能的酶标仪，在进行ELISA测定显色反应完成加入终止剂后，可不必振荡混匀，直接放人酶标仪上测定即可。
六、温育功能
温育功能是指酶标仪本身能按要求自动**地控制仪器内部的温度，使得ELISA测定中微孔板条的温育过程可在仪器内部完成，而无需再外配温箱。目前，只有少部分酶标仪具有此种功能。
七、软件功能
软件功能是指酶标仪所具有的对ELISA定性和定量测定及其他测定方式如酶标动力学、紫外和凝集等数据的统计分析并报告结果的功能。软件功能是中高档酶标仪的一个非常重要的功能。如果硬件方面区别不大，则软件就成为判定酶标仪优劣的惟一指标。对于用户来说，好的软件功能，对实际工作会有较大的帮助。ELISA定性测定，酶标仪如具有阳性判断值(cut-off)及其测定“灰区”(即指测定吸光度处于cut-off周围的一定区域，此区域内结果应为“可疑”)的统计计算功能，不但方便了实验室工作人员，而且在某些特定的情况下，有很高的实用价值。有研究表明，四参数方程能较好地反映免疫测定的剂量反应曲线，**为适合于定量酶免疫测定的曲线拟合。因此，如目的是定量测定，则在酶标仪的软件功能中，**好要有这种曲线回归方程计算分析功能。其他诸如连点、直线等回归计算，则可根据酶标仪的应用目的而定，如兼用于微量生化测定，则此类回归计算就很有必要。
八、语言界面
通常进口的中高档酶标仪人机对话多采用英文。这对于某些基层实验室可能会存在语言方面的困难，从而难以**大限度地发挥酶标仪的作用。为解决这方面的问题，已有一些酶标仪采用了中文界面。这样就大大方便了广大基层实验室技术人员的使用。
综上所述，尽管酶标仪的发展极为快速，种类繁多，功能也不断加强，但其**根本的功用是不变的，即比色测定。大凡比色测定，其基本要求就是在一定吸光度范围内要有好的测定准确性、线性和精密性。同样的吸光度范围，测定的准确性、线性和精密性越好则酶标仪亦越佳。
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